Ошибки при проведении иммуноферментного анализа

Авторы: Шаркова В.Е., ЗАО «Алкор Био», Санкт-Петербург,Власов Г.С., НПП «Медицинская  лабораторная  диагностика», Москва, Свежова Н.В., ЗАО «Алкор Био», Санкт-Петербург

Статья является результатом анализа обращений (рекламаций и вопросов) потребителей в Отдел биологического технологического контроля (ОБТК) ЗАО «Алкор Био», а также обобщения практического опыта при производстве и разработке тест-систем. Возникающие в результате постановки иммуноферментного анализа (ИФА) проблемы можно разделить на 3 группы: 1) несоответствие паспортным данным в части величины сигнала и фона; 2) дефекты калибровочного графика, в том числе непопадание контрольной сыворотки в заявленный диапазон; 3) несоответствие результата анализа клинической картине, то есть обнаружение существенной разницы между измеренной и ожидаемой концентрациями аналита на всем планшете или в индивидуальных образцах. Перечисленные проблемы могут быть как результатом ошибки при проведении ИФА, так и следствием производственного брака. Как правило, выявление брака возможно только при исследовании возвратной продукции предприятием-производителем. Следствием подтверждения наличия брака является замена изготовителем некондиционной продукции. Однако при обращении в ОБТК предприятия клиническая лаборатория должна быть уверена в правильном использовании приобретенного изделия.

Эта статья преследует две цели, с одной стороны проанализировать действия, приводящие к получению неправильных результатов, с другой стороны предложить способы проверки и устранения ситуации, способствующей возникновению неконтролируемых ошибок. Некорректные действия, влекущие за собой получение ошибочного результата, могут быть допущены на любом этапе анализа – преаналитическом, аналитическом или постаналитическом. Данная статья касается преимущественно вопросов исполнения собственно ИФА. Также рассмотрены некоторые действия клинической лаборатории на преаналитическом и постаналитическом этапах, могущие повлечь получение некорректных результатов анализа.

Преаналитический этап

Одной из причин несоответствия результата анализа и клинической картины является способ получения образцов крови пациентов для ИФА. Отсутствие регламентированного официальными документами способа забора и обработки крови с целью получения сыворотки для лабораторных исследований позволяет клиническим учреждениям использовать разнообразные одноразовые системы забора крови широкого ассортимента.

При внешней простоте эти системы устроены весьма сложно: ускорение формирования сгустка обеспечивается добавлением специальных химических реагентов, для подавления гемолиза эритроцитов и для предотвращения адгезии клеток на стенках системы используются химические агенты другой природы; для лучшего разделения жидкой и твердой фаз крови применяются инертные физические агенты. Все эти добавки могут оказывать существенное интерферирующее воздействие на иммуноанализ. Существующие документы, регламентирующие деятельность производителей этих систем, не обязывают последних к исследованию причин и механизмов интерференции. Таким образом, начиная применять в лабораторной практике ту или иную одноразовую систему, потребитель не имеет информации о потенциальном воздействии продукции на результат. Между тем, анализ литературы показывает, что одна и та же система забора может завышать измеряемую концентрацию одного аналита и занижать – другого. Дополнительное влияние на величину интерференции могут оказывать длительность контакта образца с системой, температура окружающей среды, степень перемешивания образца, факт транспортировки (Власов и др., 2006). Возможным вариантом преодоления такой ситуации может быть проведение сравнительных экспериментов с использованием выбранной одноразовой системы забора крови. За контроль в таких опытах принимается ранее принятый в конкретной лаборатории способ получения сывороток. В ходе опыта проводится определение величины и знака систематической погрешности, вносимой одноразовой системой, для каждого аналита. Результатом исследования является уточнение внутрилабораторных диапазонов нормальных значений каждого аналита. Продукция одного и того же производителя с разными номерами по каталогу, может содержать разные химические и физические агенты, следовательно, данные сравнительных экспериментов с использованием одной одноразовой системы забора крови не могут быть перенесены на другую систему.

Отсутствие документов, регламентирующих забор крови для лабораторной диагностики, может приводить к неожиданным, но правомерным вопросам потребителей наборов ИФА. Суть одной из таких претензий состоит в отсутствии в инструкциях диапазонов нормальных значений аналитов в сыворотке, полученной из капиллярной крови. Венозная и капиллярная кровь различна по газовому и биохимическому составу, что может привести к неконтролируемой интерференции в ИФА. При заборе крови из пальца трудно получить образец достаточного объема без разбавления его тканевой жидкостью. Тканевая жидкость является чужеродным матриксом для компонентов тест-системы. Таким образом, вероятность правильной трактовки результата весьма сомнительна.

Несоответствие результата анализа клинической картине может оказаться следствием несоблюдения простых правил. Если образцы были предварительно заморожены, их следует перемешать, чтобы устранить возникающий при заморозке градиент концентраций. При наличии механических включений образец следует отцентрифугировать, чтобы избежать их попадания в наконечник пипетки и, как следствие, изменения объема вносимого в среду инкубации образца. Однако нельзя допускать длительное центрифугирование и центрифугирование при высоких скоростях.

Не следует стабилизировать образцы бактериостатиками во избежание неконтролируемой интерференции в иммуноанализе.

Аналитический этап

Для аналитического этапа существенны общие требования к помещениям, приборам и посуде.

В помещениях следует поддерживать постоянство температуры и влажности. Слишком сухой воздух неизбежно приводит к проявлению краевых эффектов на планшете вследствие неравномерного испарения из лунок. Повышение температуры приводит к увеличению скоростей всех реакций, реализованных в иммуноанализе (преципитации антигена и антитела, ферментативного преобразования хромогена). Это правило справедливо и для диапазона комнатной температуры, указываемого в инструкциях к ручным наборам – 18-25ºС. Несоблюдение температурного режима может привести к получению сигнала, не адекватного спектрофотометру, и даже к изменению кинетических и равновесных параметров реакции антитела и антигена. Наилучшим способом решения проблемы является кондиционирование помещения. Альтернативным вариантом может быть проведение инкубаций ИФА, требующих комнатной температуры, в термостатируемом шейкере.

Полуавтоматические пипетки, спектрофотометры, дозирующие и измерительные части автоматических анализаторов подлежат периодической поверке. Приборы, не подлежащие поверке, могут быть источником ошибочных результатов. К ним относятся промыватели и термостатируемые шейкеры (встряхиватели). Промыватели нуждаются в визуальном контроле точности дозирования и полноты удаления жидкости из лунок, требуют мероприятий по профилактике зароста. Пренебрежение этими простыми правилами влечет появление высокого фона в анализе и высокого коэффициента вариации между дублями, «нерасхождение» калибровочных проб с низкими уровнями аналита, неправильное определение сывороток с низкими концентрациями аналита.

Источником завышения или занижения результатов во всем анализе (на всем планшете) могут быть шейкеры. Известно, что шейкеры разных производителей, настроенные на одинаковую скорость встряхивания, демонстрируют существенные различия в реальной скорости. С той же проблемой можно столкнуться при закупке шейкеров одной марки у одного и того же производителя. Поставив одинаковые анализы на двух разных шейкерах, оператор может обнаружить существенное различие в измеренной концентрации аналита в одном и том же образце пациента. Причиной такого результата часто является зависимость уровня «открытия» образцов от скорости встряхивания планшета во время инкубации. Во избежание получения различающихся результатов анализов при использовании разных единиц одноименного лабораторного оборудования рекомендуется выровнять шейкеры по реальным скоростям с помощью тахометра, зафиксировать скорость каждого прибора, откорректировать внутрилабораторные диапазоны нормальных значений каждого аналита.

При повторном использовании лабораторной посуды при постановке ИФА могут быть обнаружены высокий фон на планшете, «нерасхождение» калибраторов с низкими уровнями аналита, могут быть неправильно определены концентрации аналита в индивидуальных образцах. Причиной зачастую является осаждение белковых компонентов или хромогена на пластик и стекло посуды при предыдущих постановках ИФА или неполное отполаскивание моющих агентов. Использование одноразовых расходных материалов является наиболее простым способом избежать описанных выше проблем.

В клинической лаборатории должны предъявляться особые требования к качеству дистиллированной или деионизованной воды. При разведении концентрированных и реконструкции лиофизованных компонентов набора правильнее пользоваться свежеприготовленной водой, так как при стоянии воды происходит сдвиг рН, выщелачивание стекла  емкости, появляется зарост. Необходимое качество воды предъявляет требования к аппаратам для ее получения – требуется периодически убеждаться в отсутствии коррозии металлических частей и проводить профилактику зароста в пластиковых шлангах.

Все реагенты перед проведением анализа должны быть доведены до комнатной температуры. В противном случае можно столкнуться со слабым окрашиванием всего планшета, с усилением краевого эффекта или появлением концентрационного градиента на планшете. Наличие краевого эффекта легко отслеживается при проведении анализа в дублях, в то время как градиент концентраций методами внутрилабораторного контроля качества не выявляется и влечет за собой неправильное измерение аналита в образцах пациентов. В последнем случае при перестановке каких-либо образцов можно сделать неправильный вывод о невоспроизводимости результатов ИФА относительно другой серии того же набора. Разведение концентрированных и реконструкцию лиофизованных компонентов набора следует проводить водой комнатной температуры по тем же причинам.

Сыворотки при необходимости разводят только тем раствором, который предусмотрен инструкцией и физически присутствует в наборе. Использование воды, промывочного буфера или буфера для разведения образцов из набора, предназначенного для определения другого аналита, не допустимо, так как вызывает реструктуризацию матрикса образцов пациентов и приводит к неправильному определению концентрации аналита. Если по косвенным данным в сыворотке ожидается уровень аналита за пределами верхней границы измеряемого диапазона, такую сыворотку следует ставить в ИФА цельной и в нескольких последовательных разведениях. Это позволит избежать занижения реальной концентрации аналита и, как следствие, неправильной трактовки результата. Особое внимание этому правилу следует уделять, если ИФА реализован в одну стадию инкубации, а в инструкции к тест-системе указана граница хук-эффекта.

Реакция преципитации антигена с антителом начинается, как только первый образец, содержащий искомый аналит, попадает в лунку планшета, а не тогда, когда полностью заполненный планшет помещают в термостатируемый шейкер. Следовательно, чем быстрее будет заполнен планшет от первой до последней лунки, тем меньше повлияет разница в длительности инкубации между первой и последней заполненными лунками на результаты анализа. Наличие градиента определяемых концентраций аналита в разных по положению лунках планшета может привести к занижению или завышению истинной концентрации аналита в зависимости от конструкции тест-системы. Это означает запрет на одновременное заполнение нескольких планшетов для постановки одних и тех же сывороток в разных анализах.

При проведении инкубации ИФА при 37ºС следует учесть требования к оборудованию. Замена термошейкера на нетермостатируемый шейкер, помещенный в термостат, не может считаться адекватной. В последнем случае неизбежно усиление краевого эффекта, в разной степени характерного для планшетных анализов. Усиление краевого эффекта является следствием неравномерного нагрева планшета. При постановке анализа в монопликатах выявить краевой эффект не представляется возможным, это неизбежно приводит к неправильному определению концентрации аналита в образцах.

Упомянутое выше произвольное несоответствие задаваемых скоростей встряхивания реальным скоростям в шейкерах разных марок не позволяет производителю иммуноферментных тест-систем жестко задать этот параметр в потребительской инструкции. Клиническая лаборатория вынуждена сама подбирать скорость встряхивания планшета, сообразуясь с параметрами шейкера, диапазоном скоростей, требуемых по инструкции к тест-системе, и здравым смыслом. Интенсивность окрашивания планшета после проведения колориметрической реакции прямо пропорциональна скорости встряхивания планшета в процессе основной инкубации. Слишком низкая или слишком высокая скорость встряхивания может привести к получению общего сигнала на планшете, не соответствующего паспортным данным, при заданном в инструкции времени проведения колориметрической реакции. Кроме того, низкая скорость встряхивания способствует увеличению коэффициента вариации между дубликатами образца и снижению точности определения концентрации аналита. Чтобы избежать влияния скорости встряхивания на уровень «открытия» образцов рекомендуется провести ряд мероприятий, описанных выше при изложении требований к лабораторному оборудованию.

Планшетный анализ характеризуется существенной случайной ошибкой, выраженной как коэффициент вариации анализа – 8% (ГОСТ Р 51352-99). Эта ошибка достаточно велика, ее игнорирование, следствием которого является постановка анализа в монопликатах, может привести к неправильной трактовке результата в сыворотках с пограничными значениями аналита. В случае повторного измерения образцов может возникнуть необоснованное подозрение на внутрисерийную или межсерийную невоспроизводимость ИФА. Постановка калибровочных проб в дубликатах позволяет не удалить явный выброс одного из дублей при построении графика и, используя оставшийся репликат, адекватно построить калибровочный график. По КВ в образцах пациентов оценивается качество всего проведенного анализа, среднее значение из двух дубликатов повышает точность определения концентрации аналита.

Следует ставить в анализ столько калибровочных проб, сколько предусмотрено тест-системой. При производстве тест-систем формирование набора калибровочных проб проводится так, чтобы весь диапазон измерения описывался калибраторами с заданными концентрациями определенным монотонным образом. Произвольное уменьшение их количества (4 или 5 вместо 6), даже на линейном участке кривой, может привести к неадекватной работе расчетной программы, так как число доступных стандартов накладывает ограничения на вид будущей калибровочной кривой.

Важную роль в иммуноанализе играют методы компьютерной обработки данных, так как при неправильном использовании они могут внести существенный вклад в получение ложных результатов. Более 60% обращений потребителей в наш ОБТК связано с неправильным выбором компьютерной программы. Первым указанием на это служит непопадание контрольной сыворотки в заявленный диапазон; может наблюдаться систематическое завышение или занижение уровня аналита на всем планшете или в каком-либо узком диапазоне измеряемых концентраций. Методы компьютерной обработки данных делятся на эмпирические и теоретические; достоинством теоретических методов является частичная автоматическая коррекция случайных отклонений в отдельных точках калибровочного графика. Наиболее распространенными являются 4-параметрическая логарифмическая логистическая модель (4PL) и преобразование logit-log. Однако одного выбора способа расчета недостаточно для получения адекватных результатов. Необходима проверка корректности реализации алгоритмов расчетов, проводимых программой. Большинство специализированных программ позволяют вычислить концентрацию аналита в каждой калибровочной пробе на основании значения сигнала и соответствующих параметров графика. Расчет концентраций происходит по калибровочному графику; калибровочные пробы, по которым построен график, рассматриваются одновременно и как неизвестные образцы. Чем меньше разница между заявленной и расчетной концентрациями, тем правильнее реализован алгоритм обработки данных. Степень близости значений заявленной и расчетной концентраций оценивают в нескольких последовательных экспериментах, ни в коем случае не однократно. После выбора и проверки программы при работе с образцами пациентов рутинно проводят оценку приемлемости полученных результатов на соответствие паспортным данным, по форме калибровочного графика и по материалам контроля качества.

Вынужденное отступление от инструкции, а именно использование оборудования, не соответствующего требованиям производителя, является частным случаем внесения существенных изменений в аналитическую систему и подпадает под действие Приказа №220 (Приказ № 220, Министерство Здравоохранения РФ). Он описывает мероприятия по определению случайной и систематической погрешностей в сериях установочных экспериментов с использованием контрольных материалов. Определяются сходимость, воспроизводимость и точность рутинного количественного метода. В случае вынужденного отступления от инструкции потребитель должен быть готов к тому, что определяемые в установочных экспериментах параметры окажутся хуже, чем заявленные в технической документации производителя (NCCLSEP15-A, 2001). В случае выявления статистически достоверной систематической погрешности относительно диапазона нормальных значений аналита, указанного производителем тест-системы, проводится корректировка собственных внутрилабораторных диапазонов. Подробный план экспериментов и трактовка результатов приведены в документе NCCLSEP9-A2 (2002). Приобретение лабораторией нового оборудования также требует проведения мероприятий в соответствии с Приказом №220.

Инструкциями производителя, как правило, предусмотрено дробное использование наборов ИФА. Остаток комплектующих следует хранить в соответствии с инструкцией, не допуская контаминации растворов, их испарения, обводнения твердой фазы. Запрещается сливать избыток жидких компонентов тест-системы из лабораторной посуды обратно во флаконы, так как при контакте с лабораторной посудой свойства растворов изменяются – из конъюгатов на стекло и пластик высаживаются белковые компоненты, хромоген при контакте с воздухом и под действием света начинает окисляться. Проблемы, возникающие при несоблюдении этих правил, – невоспроизводимость результатов относительно той же серии тест-системы, завышение или занижение уровня аналита.

Под дробным использованием набора ни в коем случае не следует понимать объединение в одном анализе комплектующих разных серий. Условия производства тест-систем таковы, что комплектующие в серии адаптируют друг к другу, в том числе и по сроку годности.

Постаналитический этап

Возможны ситуации, когда обнаруживается длительное завышение или занижение результатов анализа или существенная, не соответствующая технической документации, невоспроизводимость результатов. Наличие проблемы подтверждается анализом контрольных материалов в соответствии с Приказом №220, затем проводится экспертиза   рутинных методов исследования (которая может заключаться в обращении к производителю), лабораторного оборудования и расходных материалов. Выявление существенной случайной ошибки анализа, превышающей ее величину, заявленную производителем, как правило, требует оптимизации и стандартизации условий проведения ИФА, то есть, аналитического этапа анализа.

Иногда в клинической лаборатории возникает необходимость переопределить уровень аналита сторонним методом. Само по себе обнаружение существенных различий в уровнях, измеренных рутинным методом и методом сравнения, не должно влечь за собой немедленного отказа от рутинного метода. Тем не менее, бывают случаи предъявления рекламаций со стороны клинической лаборатории, суть которых описывается как невоспроизводимость работы тест-системы относительно набора другого производителя. В таблице приведены данные по измерению аналита СА 125 в сыворотках крови пациентов тремя методами. При достаточно высокой сходимости результатов встречаются сыворотки, измерения которых разными методами существенно различаются. Они выделены жирным шрифтом; значение, резко отличающееся от двух других, обозначено курсивом.

Таблица. Концентрация аналита СА 125 в сыворотках крови пациентов, измеренная тремя методами.

Представленные данные показывают, что сравнение уровня аналита в индивидуальной сыворотке двумя методами (тест-системами) не позволяет сделать компетентное заключение о неадекватности или «неправильности» какого-либо из методов, особенно, если идет речь об аналитах гетерогенного состава (аутоантитела, ферритин, тиреоглобулин, онкомаркеры СА 125, СА 15-3, РЭА, СА 19-9). Подбирая рутинный метод исследования образцов пациентов, нужно знать ограничения в применении метода (скрининг, диагностика, мониторинг), структуру и свойства аналита, чтобы иметь  предварительное представление о возможной сходимости результатов между разными диагностическими методами. Собственно эксперименты по оценке адекватности количественного метода строятся по специальным схемам, данные обрабатываются методом ROC-анализа, результаты описываются в терминах «диагностическая чувствительность» и «диагностическая специфичность» (Kopere.a., 1997). Неспециализированная клиническая лаборатория вряд ли может выполнить исследование такого рода.

Заключение

Меры по профилактике ошибок ИФА включают в себя расширение знаний в области биологии, химии, физики и информатики; соблюдение инструкции к изделию и обращение к производителю в случае возникновения вопросов по проведению ИФА; соблюдение приказа №220. Выявление случайных погрешностей в ходе выполнения мероприятий по обеспечению контроля качества лабораторных исследований – предмет для оценки точности и воспроизводимости рутинного метода исследования конкретного аналита, проверки оборудования, повышения квалификации персонала. Выявление систематической погрешности не обязательно влечет за собой вопрос о замене рутинного метода, так как она может быть свойством комплекта лабораторного оборудования или свойством конкретного оператора, но ставит клиническую лабораторию перед необходимостью пересмотра диапазона нормальных значений того или иного аналита, относительно диапазона, указанного в инструкции к тест-системе.

При обнаружении ошибки на каком-либо этапе ИФА – преаналитическом, аналитическом, постаналитическом – она устраняется одинаковым образом:

1. Выявление, идентификация,
2. Расследование (человеческий фактор, неустойчивая работа прибора, загрязнение растворов и т.п.),
3. Документирование (причина выбраковки анализа пациента, определение периодичности повторения ошибки и причин ее возникновения),
4. Устранение – естественное завершение процесса.

Литература

1. Власов Г.С., Пономарева А.М., Полынцев Д.Г. и др. Системы забора крови и интерференция в иммуноанализе. Клиническая лабораторная диагностика, 2006. В печати.
2. ГОСТ Р 51352-99. Наборы реагентов для клинической лабораторной диагностики. Методы испытаний. Госстандарт России, Москва, 2000.
3. Приказ № 220 от 26 мая 2003 г. Об утверждении отраслевого стандарта "Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов". Министерство Здравоохранения Российской Федерации, Москва, 2003.
4. NCCLS Document EP15-A. User Demonstration of Performance for Precision and Accuracy; Approved Guideline. NCCLS catalog, 2001. Vol. 21,№25.
5. NCCLS Document EP9-A2. Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples; Approved Guideline – Second Edition. NCCLS catalog, 2002. Vol. 22,№19.
6. Koper N.P., Thomas C.M., Massuger L.F. e.a. Comparison of four 'second generation' immunoassay systems to determine CA 125  in serum by using a graphical approach to method comparison analysis. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1997. Vol. 35, № 8. PP. 617-623.