Сравнение набора реагентов “АллергоИФА-специфический IgE” и биотинилированных аллергенов компании “Алкор Био”с MAST-CLA Hitachi Chemical Diagnostics при определении специфических IgE у больных атопическими заболеваниями

По данным разных авторов, как в России, так и за рубежом до 40 % населения в той или иной форме страдают аллергическими заболеваниями, такими как аллергический ринит, бронхиальная астма, атопический дерматит, крапивница, ангиоотек, которые в большой степени обусловлены иммунными механизмами с участием специфических к тому или иному аллергену иммуноглобулинов Е (sIgE). По результатам аллергообследования больных в клинике нашего института 50-80 % (в зависимости от нозологии) обследованных являются атопиками.
Распространенность атопии определяет усилия по созданию и совершенствованию систем и средств определения уровня или в последнее время концентрации sIgE. Не вдаваясь в историю вопроса, можно заметить, что в настоящее время за рубежом наибольшее распространение получили диагностические системы ImmunoCAP (Phadia), Immulite (Siemens), MAST-CLA (Hitachi). Эти системы, прошедшие мультицентровые испытания в сравнении с тестами in vivo часто используются, как референсные, разработчиками новых методов анализа.
Созданный в 1976 г. MAST-CLA тест [1] прошел испытания в сравнении с кожными пробами, провокационными тестами и методами in vitro диагностики, включая ImmunoCAP [2, 3, 4] . В MAST-CLA тесте реализован иммунохемилюминесцентный метод анализа. В качестве твердой фазы в методе используются целлюлозные нити, на которые ковалентно присоединен препарат аллергена. Нити заключены в плоский проточный элемент, что упрощает и ускоряет промывку. На первой стадии анализа происходит сорбция сывороточных sIgE. После промывки и удаления не связавшихся компонентов сыворотки иммобилизованные sIgE проявляются конъюгатом поликлональных анти- IgE антител с пероксидазой хрена. На завершающей стадии ферментативной реакции в качестве субстрата используется люминол. Интенсивность хемилюминесценции регистрируется фотоумножителем. Результаты анализа выражаются в классах от 0 до 4.
В 90-е годы в Европе появляются разработки нового метода для количественного определения sIgE, в которых используются твердая фаза с сорбированными специфичными к IgE антителами и биотинилированные аллергены. Так, компания Radim Diagnostics, в 1993 г. предложила вариант анализа, отличавшийся улавливанием твердой фазой преформированных в растворе иммунных комплексов sIgE-биотинилированный аллерген, что сокращало время исследования [5]. Дальнейшее развитие этот метод, названный реверсивный аллергосорбентный тест, получил в компании «Алкор Био» (г. Санкт-Петербург, Россия) и был реализован в наборе «АллергоИФА-специфический IgE» с биотинилированными аллергенами [6]. Анализ выполняется на полистироловых планшетах в стандартной технике ИФА и не требует специального оборудования. Анализ удобен для выполнения независимо от производительности клинической лаборатории. Достигается это использованием единого для всех аллергенов иммуносорбента – планшета, в лунках которого иммобилизованы анти-IgE антитела. Создание иммуносорбента на основе антител, а не препарата аллергена придает анализу гибкость, способность к формированию произвольного репертуара аллергенов по показаниям врача, а также снижает неспецифические реакции. Аллерген же несет на себе биотиновую метку и проявляетcя на твердой фазе в составе иммунных комплексов с sIgE конъюгатом специфичного к биотину белка с пероксидазой хрена. Окончание анализа фотометрическое. Результаты регистрируются на любом вертикальном планшетном фотометре.
В представленной работе была поставлена задача сравнения двух современных методов аллергодиагностикина примере наборов «АллергоИФА-специфический IgE» и биотинилированных аллергенов («Алкор Био») и MAST-CLA (Hitachi Chemical Diagnostics)
Материалы и методы
Для испытаний были взяты 6 отечественных биотинилированных аллергенов: береза бородавчатая (t3), полынь обыкновенная (w6), эпителий кошки (e1), домашняя пыль (h1), клещи Dermatophagoides pteronissinus (d1) и Dermatophagoides farina (d2).
Каждый аллерген испытывали на 20 контрольных и 20 положительных (по данным MAST-CLA) сыворотках больных госпитализированных в клинику института с диагнозами бронхиальная астма, атопический дерматит, аллергический ринит. Средний возраст – 28,23±16,5 лет, 54 % в выборке составляли мужчины, 46 % - женщины.
Скарификационные тесты за исключением единичных случаев не проводились, вследствие госпитализиции больных в стадии обострения основного заболевания, невозможности отмены антигистаминных и кортикостероидных препаратов. Аллергию к тому или иному аллергену подтверждали совпадением лабораторных тестов с анамнезом заболевания, а также результатами элиминационных мероприятий.
Аллергообследование проводили с использованием MAST-панелей «Российская панель IV» (Hitachi Chemical Diagnostics), биотинилированных аллергенов и наборов «АллергоИФА-специфический IgE» («Алкор Био»).
Результаты обрабатывали с помощью программы StatSoft Statistica 8.0.

Результаты и обсуждение
Из полученных данных (Рис.1) видно, что больные, страдающие заболеваниями, вызванными или отягощенными атопией и проходящие лечение в условиях стационара имеют ярко выраженную сенсибилизацию к причинным аллергенам, во всяком случае, при оценке в классах MAST. При рассмотрении результатов следует помнить, что 4 класс MAST не имеет верхней границы. Это обстоятельство могло сказаться на силе корреляции результатов. В целом, полученные коэффициенты корреляции (Табл.1) следует принять хорошими для аллергенов t3, w6, e1, h1 и удовлетворительными при параметрической оценке для аллергенов d1 и d2.

Рис.1. Диаграммы рассеяния при определении sIgE к 6 аллергенам ИФА с биотинилированными аллергенами и MAST-CLA.
По оси абсцисс отложены классы MAST, по оси ординат – ед/мл sIgE.

Значения У-интерсепта близко к 0 для аллергена пыльцы березы (t3) и невелико для аллергенов пыльцы полыни (w6), домашней пыли (h1) и эпителия кошки (e1).
Отрицательные интерсепты для клещевых аллергенов (d1, d2), очевидно, требуют уточнения в дальнейших исследованиях с накоплением данных в области первых классов MAST.
Таблица 1. Клинические характеристики и корреляционный анализ

  
Значения специфичности, полученной для набора «АллергоИФА-специфический IgE» и биотинилированных аллергенов производства «Алкор Био», в среднем выше, чем в опубликованных сравнительных исследованиях других методов, например MAST-CLA и ImmunoCAP [4]. Это уменьшает риск гипердиагностики. Клиническая же чувствительность для всех аллергенов, кроме домашней пыли ниже, чем у MAST-панелей.
На основе уже имеющегося опыта работы с биотинилированными аллергенами следует добавить, что метод устойчив к таким факторам неспецифических реакций, как сывороточный гемолиз, повышенное содержание общего IgE и не идентифицированным в настоящее время индивидуальным сывороточным факторам неспецифического связывания твердой фазой.

   Выводы
1. Проведенное исследование показало высокую специфичность и хорошую чувствительность реверсивного аллергосорбентного теста. Биотинилированные аллергены и наборы «АллергоИФА-специфический IgE» компании «Алкор Био» могут быть рекомендованы к использованию в практике клинико-диагностических лабораторий.
2. В случае обследования на стадии дебюта аллергического заболевания, если требуется высокая чувствительность, можно использовать MAST-CLA метод.
3. Набор «АллергоИФА-специфический IgE» показал хорошую корреляцию с MAST-CLA для аллергенов t3 (береза бородавчатая), w6 (полынь обыкновенная), e1 (эпителий кошки) и h1 (домашняя пыль).
Авторы выражают благодарность компании «Алкор Био» за предоставление наборов и реагентов для проведения испытаний.

Литература
1. Соболев А.В., Аак О.В. Современная аллергодиагностика: опыт работы //Hi+Med. Высокие технологии в медицине. – 2011. – вып. №2. – С.8-10.
2. Nepper-Christensen S., Backer V., DuBuske L.M., Nolte H. In vitro diagnostic evaluation of patients with inhalant allergies: summary of probability outcomes comparing results of CLA- and CAP-specific immunoglobulin E test systems // Allergy Asthma Proc. – 2003. – Vol.24. - №4. – P. 253-258.
3. Miller S.P., Marinkovich V.A., Riege D.H., Sell W.J., Baker D.L., Eldredge N.T., Dyminski J.W., Hale R.G., Peisach J.M., Burd J.F. Application of the MAST™Immunodiagnostic system to the determination of allergen-specific IgE // Clin.Chem. – 1984.- Vol.30. - №9.- P.1467-1472.
4. Ruzzenente O., Lippi G., Dima F., Bertasini A., Guidi G.C. AP 1800HCD: towards automation of the CLA assay // Giorn.It.Allergol.Immunol.Clin. – 2004. – Vol.14. – P.165-171.
5. Plebani M., Bernardi D., Basso D., Borghesan F., Faggian D. Measurement of specific immunoglobulin E: intermethod comparison and standardization // Clin.Chem. - 1998. - Vol.44. - № 9. – P. 1974-1979.
6. Кочиш Л.Т. Высокотехнологичная компания “Алкор Био”: современный подход к разработке и производству иммуноферментных тест-систем для аллергодиагностики // Справочник заведующего КДЛ. – 2011. - №4. – С.33-36.