Биология простат-специфического антигена и его диагностическая значимость

Автор: Свежова Н.В. (ЗАО «Алкор Био», Санкт-Петербург, Россия)

 

В обзоре представлены современные данные по биологии простато-специфического антигена, его свободным и связанным формам в циркуляции и тканях, их использованию в диагностике рака предстательной железы и доброкачнственной гиперплазии простаты.

 

Простато-специфический антиген (ПСА) является маркером рака предстательной железы. Он используется для  мониторинга эффективности терапии, оценки размера опухоли, определения рецидива болезни, а также для раннего определения рака простаты.

 

Биология ПСА

 

Характеристика биомолекулы

 

ПСА является сериновой протеазой, выделяемой, в основном, эпителием человеческой простаты. В норме ПСА секретируется в семенную жидкость в высоких концентрациях (2-5 г/л). В середине 80-х гг было показано, что ПСА расщепляет семеногелины I и II и фибронектин, что в результате приводит к разжижению семенного сгустка после эякуляции. Впоследствии было показано, что ПСА обладает химотрипсиноподобной ферментативной активностью. Выделенный из семенной жидкости ПСА представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 34 кДa. Это глобулярный белок, состоящий из одиночной полипептидной цепи, включающей 240 аминокислотных остатков (237 по данным генетического анализа) и содержащий приблизительно 8 % углеводов (Рис. 1). Молекулярная масса углеводного фрагмента составляет приблизительно в 2300 Да. В молекуле ПСА имеется лишь один сайт гликозилирования – аспарагин в позиции 45. Большой вклад в формирование геометрии молекулы вносят три дисульфидные связи, формирующие гистидиновую петлю, ответственную за правильную ориентацию остатка гистидина в активном центре, метиониновую петлю и сериновую петлю. В полипептидной цепи ПСА были обнаружены образующие заряженную систему аминокислотные остатки, состав и положение которых типичны для активного центра сериновых протеаз (гистидин-41, аспартат-96, серин-192) [1-5].

Рисунок 1. Аминокислотная последовательность молекулы ПСА с углеводным фрагментом (Из [1])

 

Ген ПСА, родственные ему гены, их продукты и  регуляция

 

Ген ПСА состоит из 4 интронов и 5 экзонов, его размер примерно 6 тыс. пар оснований. Он принадлежит к большому семейству генов, кодирующих калликреиноподобные сериновые протеазы (сейчас их известно 15). Все эти гены тандемно расположены в калликреиновом локусе хромосомы 19q13.2-13.4 (Рис.2) и представляют собой самый большой локус сериновых протеаз в геноме человека. Помимо ПСА (hK3), из представителей этого семейства хорошо изучены тканевой калликреин (hK1) из поджелудочной железы и человеческий гландулярный калликреин (hK2). Гены калликреинов имеют высокую степень гомологии между собой. Самой большой степенью гомологии с геном ПСА обладает ген гландулярного калликреина человека (hK2) – 78 % . Гомология между этими белками по аминокислотной последовательности составляет 80 % [6, 7].

 

 

Рис.2. Локус калликреиновых генов на хромосоме 19q13.4. Названия генов представлены внутри стрелок. Под стрелками жирным шрифтом показаны унифицированные названия продуктов этих генов. Над стрелками указаны длины генов, под стрелками на выносках – расстояния между генами. Расстояния и длины генов на рисунке представлены не в масштабе. Заливкой отмечены гены, продукты которых обсуждаются в тексте статьи. Головки стрелок показывают направление транскрипции. Гены Siglec 9 и ACPT – не являются членами калликреинового семейства. (Из [7])

Калликреины проявляют трипсиноподобную (11 белков, в том числе hK2) или химотрипсиноподобную (ПСА) ферментативную активность. Все эти белки синтезируются как пре-про-пептиды, на N-конце которых находятся, состоящий из 17-20 аминокислотных остатков (АК) сигнальный пептид и 4-9 АК-ный активационный пептид. Экспрессия практически всех генов калликреинового семейства, в том числе и гена ПСА, контролируется стероидными гормонами [8-16]. Многие калликреины экспрессируются в эндокринных или эндокрино-зависимых органах. Например, практически все калликреины экспрессируются в ткани молочной железы. В ткани яичников и в клеточных линиях рака яичников экспрессируются 8 из 15 генов этого семейства. Большинство калликреинов в разных объемах экспрессируется в тканях простаты и семенников [7].

Кроме предстательной железы, ПСА в сравнительно высоких концентрациях был обнаружен и в других органах. У женщин его обнаруживают в грудном молоке, аспирате молочной железы, амниотической жидкости, экстрактах опухолей яичников и молочной железы. Это дает основания предполагать, что ПСА реализует свои биологические функции не только в простате, но и в молочной железе и других тканях и может также играть роль в развитии плода [17].

 

Биосинтез и биологические функции ПСА

 

Общая продукция ПСА в клетках эпителия простаты и в семенной жидкости определяется несколькими факторами: уровнем экспрессии гена ПСА, нормой секреции белка в клетке и общим количеством клеток, выделяющих ПСА.

В клетках эпителия простаты ПСА транслируется в форме пре-про-пептида, при прохождении через секреторный путь отщепляется 20 АК-ный N-концевой сигнальный пептид и ПСА выделяется в семенную жидкость в форме про-фермента с активационным пептидом, состоящим из 7 АК. В семенной жидкости происходит активация ПСА под действием hK2, что показано в опытах in vitro. При этом отщепляется активационный пептид. Также условиях in vitro была показана активация ПСА под действием других членов калликреинового семейства – hK15 и простазы (hK4) [18,19] (Рис.3).

 

 

 

Рисунок 3. Биосинтез, активация и биохимическое окружение ПСА.

 

Основными физиологическими субстратами активного ПСА, равно как и постоянно сосуществующего с ним в семенной плазме и крови гландулярного калликреина (hK2), являются семеногелины I и II, а также фибронектин. Ферментативную активность ПСА и других калликреинов подавляют многие ингибиторы сериновых протеаз. Самые распространенные из них – α-2-макроглобулин(α-2-macroglobulin, АМG) и α-1-антихимотрипсин (α-1-antichymotrypsin, ACT). Кроме того, связывание ионов Zn²⁺ с молекулой ПСА также подавляет ее ферментативную активность. За физиологические субстраты и ингибиторы с ПСА конкурируют другие сериновые протеазы калликреинового семейства – гландулярный калликреин человека (hK2) и простаза (hK4), а также катепсин Д [20]. ПСА и hK2 всегда сосуществуют в семенной жидкости и выполняют сходные функции, однако hK2 менее активно, чем ПСА, расщепляет физиологические субстраты и с меньшей силой связывается с ингибиторами.[u1]

На участие ПСА в патологическом процессе указывает тот факт, что его содержание в пораженных раком тканях простаты ниже, чем в соседних здоровых участках того же органа. Для проверки этого предположения были проведены многочисленные исследования, как на культурах клеток эпителия простаты (первичных культурах рака простаты и трансформированных линиях эпителия простаты), так и на биопсийном материале от больных с раком и доброкачественной гиперплазией простаты. Результаты этих исследований весьма противоречивы. Оказалось, что в опытах на клеточных культурах ПСА в концентрациях, типичных для сыворотки крови, выступает как ингибитор роста клеток и индуктор апоптоза. В клинических исследованиях биопсий, наоборот, было показано, что под действием ПСА происходит слабая стимуляция роста клеток эпителия и стромы простаты. Авторы клинических исследований объясняют этот факт тем, что, как было ранее продемонстрировано in vitro, ПСА высвобождает мощный митоген – инсулино-подобный фактор роста 1 (IGF1) – из комплекса со связывающим его белком. При этом колокализация ПСА и активированного IGF1 в пораженных раком участках простаты была показана иммуноцитохимически [21].

 

Формы ПСА, существующие в ткани простаты и в сыворотке крови

 

Основной формой (98 %) ПСА в ткани простаты независимо от ее происхождения (здоровая/ доброкачественная/ злокачественная) является свободный ПСА (fPSA) (Рис. 4). Концентрация общего ПСА (tPSA) ниже в злокачественно измененной ткани простаты, чем в лишенной раковых клеток части той же самой простаты. В результате многочисленных исследований было показано, что концентрация ПСА в тканях не коррелирует ни с концентрацией в сыворотке, ни со стадией рака [19, 21, 23, 24].

 

 

Рисунок 4. Изоформы и комплексные формы ПСА в ткани простаты.

 

Весь ферментативно активный ПСА, который проникает в межклеточную жидкость и сыворотку, необратимо инактивируется связыванием с АСТ и AMG, которые являются ингибиторами сериновых протеаз. Эти белки синтезируются в печени. Их молярная концентрация в сыворотке в 104 раз выше концентрации ПСА, поэтому фракция свободного ПСА в сыворотке представлена лишь ферментативно неактивными молекулами, не способными связывать ингибиторы (Рис. 5.). Эта фракция  примерно в равных долях состоит из трех ферментативно неактивных форм ПСА: proPSA (pPSA), «benign» (BPSA) и так называемых «урезанных» форм pPSA. BPSA был впервые выделен из ткани доброкачественной гиперплазии простаты, за что и получил свое название. Он является продуктом протеолиза нативного зрелого ПСА с разрывом внутренних пептидных связей при аминокислоте Lys182-183 или Lys145-146. Так называемые «урезанные» формы pPSA – это также результат протеолиза с отщеплением от pPSA 2, 4 или 6 АК из 7 АК активационного пептида.[u2]

 

 

 

Рисунок 5. Изоформы и комплексные формы ПСА в сыворотке крови мужчин, больных раком простаты (концентрация общего ПСА 4-10 мг/л[u3] ).[u4]

 

Комплекс ПСА с АСТ является преобладающей иммунореактивной формой ПСА в сыворотке. Комплекс ПСА-макроглобулин не доступен для иммунодетекции из-за стерического экранирования эпитопов, но его концентрация в сыворотке даже несколько превышает концентрацию комплекса ПСА-АСТ. В сыворотке здорового мужчины примерно 20 % ПСА находится в свободной форме, 45 % – в комплексе с макроглобулином и 35 % – в комплексе с АСТ. Помимо ACT и AMG, ПСА может также связываться с некоторыми другими ингибиторами сериновых протеаз, такими как PZP (pregnancy-zone protein), PCI (protein C inhibitor) и α-1-антитрипсин, но доля этих комплексов в крови невелика, и в диагностических процедурах ими можно пренебречь.[u5]

 

Факторы, влияющие на концентрацию ПСА в сыворотке крови

 

В нормальных условиях ПСА секретируется люминальными эпителиальными клетками и затем выводится через каналец простаты в семенную жидкость, где его концентрация может в миллионы раз превышать сывороточную (от 0,24 до 5,50 г/л, среднее значение 1,92 г/л). Если клеточные контакты между клетками эпителия и базальная мембрана не нарушены, а канальцы проходимы, резорбция ПСА в межклеточную жидкость и сыворотку минимальна. Обструкция канальцев, нарушения целостности плотных клеточных контактов или самой базальной мембраны приводит к «утечке» ПСА в межклеточную жидкость простаты с последующим проникновением в циркуляцию. Нарушение целостности базальной мембраны может происходить при инфаркте простаты, простатите или манипуляциях с простатой. Увеличение уровня ПСА в сыворотке может быть результатом, как усиленной секреции, так и нарушения структуры ткани.

Нормальный уровень ПСА в сыворотке здоровых мужчин варьирует в зависимости от физической нагрузки, сексуальной активности и индивидуальной физиологии. Верхний предел нормы концентрации ПСА в сыворотке колеблется по разным данным от 1 до 4 мкг/л[u6] , хотя и при низких значениях ПСА существует 1-5 % вероятность обнаружения рака простаты. По имеющимся наблюдениям, уровень сывороточного ПСА не подвержен существенным суточным колебаниям. Различия при многократном серийном измерении не превышали 10 %. Обнаружено, что после госпитализации уровень сывороточного ПСА уменьшается. Это может происходить за счет снижения физической активности или неподвижности. Уровень сывороточного ПСА увеличивается при сексуальной активности или ректальном пальцевом исследовании (РПИ). Цитоскопия может увеличивать уровень ПСА в четыре раза, а биопсия с помощью иглы или трансуретральная резекция могут приводить к 50-кратному увеличению уровня ПСА [22]. Эти изменения происходят за счет увеличения «утечки» в сыворотку. Поэтому при диагностике следует учитывать все вышеперечисленные причины повышения концентрации ПСА в сыворотке крови.

Основным фактором, определяющим уровень ПСА в сыворотке крови, является объем эпителиальных клеток простаты. В раковых клетках, по сравнению с нормальными, не наблюдается существенного увеличения продукции ПСА в расчете на клетку. Повышение уровня ПСА в сыворотке происходит в результате так называемой «утечки» (backleak), инфильтрации раковых клеток в строму, а также за счет более плотной, по сравнению с нормальной, популяции раковых клеток в пересчете на кубический миллиметр ткани. Для доброкачественной гиперплазии простаты (ДГП) уплотнение клеточной популяции не характерно [23].

Большинство биохимических агентов не влияет на уровень циркулирующего ПСА. Исключением являются вещества, блокирующие синтез тестостерона, или снижающие его концентрацию. Уровень циркулирующего ПСА может также понижаться под действием каротиноидов и других производных витамина А.[u7]

 

Диагностическая значимость PSA

 

Уровень ПСА в сыворотке крови здоровых мужчин составляет менее 4 мкг/л[u8] , в то время как уровень ПСА в семенной жидкости в 100 раз выше и составляет 0,2 – 5 г/л. Концентрация ПСА в сыворотке крови женщин еще ниже, чем у мужчин, и составляет приблизительно 0,2-0,3 мкг/л[u9] .

«Биологический ноль»[u10] ПСА непростатического происхождения в циркуляции был определен на уровне 8,0 нг/л[u11] . Такие концентрации ПСА в сыворотке крови достигаются через несколько недель после радикальной простатэктомии или других экстремальных воздействий, таких как гормональная терапия или облучение. В норме период полужизни свободного ПСА составляет 1-2 часа. Для ПСА, связанного с одним из ингибиторов сериновых протеаз, период полужизни составляет 2-3 дня. В экспериментах на крысах было показано, что комплекс ПСА-AMG выводится из организма только через печень, в то время как ПСА-АСТ выводится и через печень и через почки.

Основой для использования ПСА как сывороточного маркера рака простаты служит феномен «утечки» ПСА из ткани опухоли простаты в кровяное русло. В настоящее время не существует таких эталонных методов определения ПСА, которые были бы признаны во всем мире. Стандартизация тестов на ПСА остро дискутируется на международных конгрессах. Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам США (1997) рекомендует использование в качестве стандартных реагентов для калибровки тест-систем 100 % fPSA, 100 % PSA-ACT комплекс и смесь, состоящую из 90 % PSA-ACT и 10 % fPSA. Другой, так называемый «стэндфордский», стандарт состоит из 100 % fPSA и 90:10 PSA (10 % fPSA и 90 % PSA-ACT комплекса). Этот набор реагентов в настоящее время предложен как стандарт ВОЗ [25].

Проведенный в 1994 году мультицентровый скрининг рака простаты показал, что рак предстательной железы выявляется у 10 % мужчин с концентрацией ПСА в сыворотке < 4 мг/л[u12] и у более 80 % мужчин с уровнем ПСА >20 мг/л[u13] . Кроме того, у большинства пациентов с уровнем ПСА < 10 мг/л[u14] были выявлены ранние стадии, в то время как у 50 % пациентов с уровнем ПСА > 10 мг/л[u15] – поздние стадии заболевания (рис. 6). Эти результаты показывают необходимость использования низких пороговых уровней (cutoff) ПСА для раннего распознавания рака простаты. Однако использование при скрининге типичной популяции повсеместно принятого уровня 4 мг/л[u16] приводит к ложно-положительному результату в 65 % случаев. В начале 1990-х гг. в серии больших исследований было показано, что определение ПСА дает лучшие результаты, чем РПИ (digital rectal examination, DRE) или любые другие скрининговые процедуры, и что комбинация определения ПСА с РПИ наиболее эффективна для раннего определения рака простаты.[u17]

 

                                                а                                                                              б

 

Рисунок 6. Концентрации ПСА в сыворотке крови и соответствующая им вероятность наличия злокачественного заболевания простаты (probabilityofprostatecancer, PPV) по данным из различных источников:

а– из[27] European Association of Urology  GUIDELINES ON PROSTATE CANCER G. Aus, C.C. Abbou, A. Heidenreich, H-P. Schmid, H. van Poppel, J.M. Wolff, F. Zattoni  UPDATE FEBRUARY 2003 [u18]

б– из[28]

 

Биологически высокий уровень ложно-положительных результатовсвязан с тем, что ПСА – скорее простатоспецифическая, чем ракоспецифическая молекула, поскольку концентрация ПСА в сыворотке также растет при ДГП, интраэпителиальной неоплазии, ишемии или инфаркте простаты,  простатите, остром или хроническом воспалении простаты. Приблизительно 20 % пациентов с раком простаты имеют уровень ПСА < 4 мг/л[u19] , что составляет ложно-негативный уровень.

Многие исследователи предпринимают активные попытки усовершенствовать ПСА – скрининг, особенно в диапазоне концентраций 4-10 мг/л[u20] . Эти усовершенствования касаются измерения плотности ПСА (отношения концентрации ПСА в сыворотке крови к объему предстательной железы), динамики, возрасто- и расо-специфических уровней нормы. Было показано, в частности, что специфичность скрининга ПСА можно увеличить при измерении соотношения свободного ПСА к общему ПСА (рис. 6а, 6б, 7). Это приводит к уменьшению на 19-64 % количества ненужных биопсий у мужчин с уровнем общего ПСА 4-10 мг/л[u21] , в то время как только 5-10 % исследований остаются ложно-негативными. При использовании этого соотношения, рак простаты может быть обнаружен у мужчин с уровнем ПСА < 4 мг/л[u22] , что увеличивает чувствительность в сравнении с таковой, полученой при измерении только общего ПСА [20-23,26].

Кроме того, дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных поражений простаты способствует разное соотношение свободной и связанных форм, также различных изоформ ПСА при разных заболеваниях [22, 24, 26] (Рис. 7). Поэтому наиболее перспективным направлением развития ПСА-диагностики в настоящее время является разработка методов определения различных молекулярных форм ПСА в сыворотке крови.

 

 

Состояние организма	концентрация tPSA	fPSA		PSA-ACT
		pPSA	BPSA
Норма	< 0,5 мг/л[u23]	10-20 % от tPSA		70-80 % от tPSA
Рак простаты	варьирует	10-30 % от tPSA		70-90 % от tPSA
		2/3	1/3
Доброкачественные заболевания простаты	варьирует	70-90 % от tPSA[u24]		10-30 % от tPSA
		1/3	2/3

 

Рис. 7. Соотношение различных форм ПСА в сыворотке крови в норме и при патологии. tPSA – общий ПСА, fPSA – свободный ПСА, pPSA – пре-ПСА , BPSA – «benign» ПСА – форма ПСА, выделенная из ткани доброкачественной опухоли простаты, PSA-ACT – комплекс ПСА с α-1 – антихимотрипсином.

 

Список литературы

 

1. Wang M.C., Valenzuela L.A., Murphy G.P. e.a. Invest. Urol. 1979; 17: 159–163.
2. Sensabaugh G.F. J. Forensic. Sci. 1978; 23: 106-115.
3. Watt K.W., Lee P.J., M’Timkulu T. e.a. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986; 83: 3166-3170.
4. Rittenhouse H.G., Finlay J.A., Mikolajczyk S.D. e.a. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 1998; 35: 275-368.
5. Robert M., Gibbs B.F., Jacobson E. e.a. Biochemistry. 1997; 36: 3811-3819.
6. Yousef G.M. , Diamandis E.P. Endocrine Reviews. 2001 22: 184-204.
7. Diamandis E.P. , Yousef G.M. Clin. Chem. 2002. 48: 1198-1205.
8. Yousef G.M., Scorilas A., Jung K. e.a. J. Biol. Chem. 2001. 276: 53-61.
9. Yousef G.M., Scorilas A., Magklara A. e.a. Gene. 2000. 254: 119-28.
10. Riegman P.H., Vlietstra R.J., van der Korput H.A. e.a. Mol. Cell. Endocrinol. 1991. 76: 181-90.
11. Riegman P.H., Vlietstra R.J., van der Korput J.A. e.a. Mol. Endocrinol. 1991. 5: 1921-30.
12. Yousef G.M., Luo L.Y., Scherer S.W. e.a. Genomics. 1999. 62: 251-9.
13. Yousef G.M., Diamandis E.P. J. Biol. Chem. 1999. 274: 37511-6.
14. Nelson P.S., Gan L., Ferguson C. e. a. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. 96: 3114-9.
15. Myers S.A., Clements J.A. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2001. 86: 2323-6.
16. Yousef G.M., Magklara A., Chang A. e.a. Cancer Res. 2001. 61: 3425-31.
17. Black M.H., Diamandis E.P. Breast Cancer Res. Treat. 2000. 59: 1-14.
18. Kumar A., Mikolajczyk S.D., Goel A.S. e.a. Cancer Res. 1997. 57: 3111-3114.
19. MikolajczykS.D., Rittenhouse H.G. Keio J. Med. 2003. 52: 86-91.
20. Diamandis E.P. Clin. Chem. 2000. 46: 896-900.
21. Ward A.M., Catto J.W.F., Hamdy F.C. Ann. Clin. Biochem. 2001. 38: 633-651.
22. Brawer M.K. CA Cancer J. Clin. 1999. 49: 264-281.
23. Balk S.P., Ko Y.-J., Bubley G.J.J. Clin. Oncol. 2003. 21: 383-391.
24. Stephan C., Jung K., Lein M. e.a. Cancer Epidem. Biomark. Preven. 2000. 9: 1133-1147.
25. Rafferty B., Rigsby P., Rose M. e.a. Clin. Chem. 2000. 46: 1310-1317.
26. Jain S., Bhojwani A.G., Mellon J.K. Postgrad. Med. J. 2002. 78: 646-650.
27. Вставить сслылку из-под рисунка №6[u25] .
28. Catalona W.J. e.a. JAMA. 1998.279: 1542-1547. Aus G., Abbou C.C., Bolla M. e.a. Eur. Urol. 2005. 48: 546-51.
29. Aus G., Abbou C.C., Bolla M. e.a. Eur. Urol. 2005. 48: 546-51.[u26]