Отправить письмо
Алкор БИО
Русский
Задать вопрос

Методы математической обработки данных в иммуноферментном анализе. II. Сравнительная оценка реализованных в различном программном обеспечении математических методов обработки данных ИФА

Авторы: Свежова Н.В., Шаркова В.Е., Громов Д.Б., Головаченко В.А., Полынцев Д.Г.

ЗАО «Алкор Био», Санкт-Петербург

 

Задачей этого раздела работы являлось сравнительное исследование реализованных в различных приборах и программном обеспечении методов расчета калибровочных зависимостей. Основными целями исследования были:

1) проиллюстрировать ряд положений теоретической части статьи, а именно:

  • результаты обработки данных при использовании теоретических (параметрических) методов, реализованных в программном обеспечении (ПО) разных производителей, имеют более высокую межметодную сходимость по сравнению результатами, полученными с помощью эмпирических методов,
  • при сравнении разных эмпирических методов обнаруживается значительная вариабельность результатов,
  • в ПО существуют некорректные реализации методов расчета калибровочных кривых; и

2) конкретизировать практические рекомендации по применению в рутинных анализах тех или иных, доступных клиническим лабораториям, возможностей.
Методы математической обработки данных в иммуноферментном анализе.

 

 II.  Сравнительная оценка реализованных в различном программном обеспечении математических методов обработки данных ИФА

Иммуноферментный анализ (ИФА) имеет целью определение концентрации искомого аналита в пробах пациентов. Для этого на основании оптических плотностей калибровочных проб и присвоенных им концентраций должна быть построена калибровочная кривая (КК). В первой части статьи были рассмотрены теоретические предпосылки выбора математического метода рассчета КК в ИФА. Вторая часть  статьи посвящена обоснованию теоретических выкладок с использованием экспериментальных данных.

 

Материалы и методы

Для уменьшения влияния неконтролируемых факторов, таких как точность пипетирования, температура и влажность в помещении и других межлабораторных различий в условиях проведения анализа, на определение концентрации аналита в пробах пациентов в реальном ИФА, калибровочные пробы (КП) и пробы пациентов имитировали при помощи стекол разной оптической плотности, установленных в планшете вместо лунок с растворами. Для этого использовали стекла, входящие в комплект для поверки ИФА-ридеров КСП-01 производства ГМП «МАРТ» ЗАО «ДЕСМО», а также специально изготовленные стекла производства ООО «Метромед». Характеристики стекол, оптические плотности (ОП) которых имитируют ОП КП и проб пациентов после остановки стоп-реагентом ферментативной реакции, представлены в таблице 1. Все измерения ОП проводили при длине волны 450 нм. Выбор диапазона ОП стекол 0,4 - 2,2 был обусловлен наибольшей воспроизводимостью измерений в этой области большинством ИФА-ридеров. ОП всех стекол были многократно переизмерены на прошедшем поверку приборе Multiscan EX(Labsystems) и по средним значениям ОП из большого числа стекол были выбраны 6 для имитации КК и 9 для имитации проб пациентов. Стекла были подобраны так, чтобы их ОП имитировали реально проведенный конкурентный ИФА.Стеклам, игравшим роль калибровочных проб, были присвоены номиналы калибраторов этого реального анализа (Рис. 1, Табл. 1). Выбор для создания модели конкурентного, а не сэндвич-анализа обусловлен тем, что нелинейная природа зависимости сигнала от концентрации в этом типе ИФА создает большое число проблем при построении КК и вычислении концентрации сывороток. Следовательно, использование именно этой модели позволит выявить наибольшее количество «слабых мест» в работе различных методов расчета калибровочных зависимостей и алгоритмов их реализации в конкретном ПО.

В эксперименте анализировали ПО наиболее широко используемых на территории Российской Федерации ИФА-ридеров. Работу проводили на ридерах, проходящих ежегодную поверку. Кроме того, чтобы удостовериться в стабильности работы фотометра, ОП стекол, установленных в планшете определяли 10-кратно. Ридеры, фотометры которых демонстрировали коэффициент вариации ОП выше 1 %, были исключены из исследования.

ПО ридеров, участвовавших в исследовании, предоставляет пользователю выбор из 2-10 программ. Для нашего исследования из них были выбраны наиболее часто встречающиеся и соответственно широко используемые методы расчета калибровочных зависимостей: два эмпирических метода – кусочно-линейный метод и кубический сплайн, и два теоретических метода – 4PLи 5 PL. Были изучены 8 ридеров и 11 вариантов ПО, из них только в 6 вариантах ПО имелись параметрические методы (Табл. 2).

По ОП каждого из 10-ти измерений имитационного планшета строили калибровочные графики и вычисляли по ним концентрации «проб пациентов» с помощью каждой из выбранных программ, предоставляемых встроенным или внешним ПО на каждом тестируемом ридере. ОП стекол имитационного планшета, считываемые фотометрами разных анализаторов, несколько различались, поэтому для объективизации сравнения аналогичные вычисления референтным методом проводили, используя те же ОП, что использовали для вычисления изучаемым методом. В качестве метода сравнения (референтный метод) был использован метод 5PLиз разработанной ЗАО Алкор Био программы ИфаМастер. Основанием для выбора этого метода в качестве референтного в рамках представленного исследования служило:

1) из литературных данных (2-5) следует, что 4-х или 5-и параметрические логарифмические логистические методы построения КК наиболее точно соответствуют природе существующих в ИФА зависимостей сигнал-концентрация, а результаты, полученные с их помощью, имеют наименьшую вариабельность и высокую воспроизводимость; вследствие чего эти методы рассматриваются в настоящее время как оптимальные для практического применения,

2) случайные ошибки, происходящие при постановке реального ИФА, оказывают меньшее влияние на результирующую КК при ее построении с использованием теоретических методов, по сравнению с эмпирическими,

3) в ходе разработки и испытаний программа ИфаМастер прошла тщательное тестирование, в результате которого была установлена достаточная надежность работы реализованного в этой программе метода 5PLи достоверность получаемых результатов,

4) метод 5PLпрограммы ИфаМастер показал высокую сходимость результатов, полученных по описанной выше методике, с результатами большей части протестирован-ных параметрических методов (Рис. 2),

5) программа ИфаМастер, будучи внешним ПО, позволяет оперировать данными ОП, полученными на любом тестируемом оборудовании, то есть вводить ОП вручную.

Нормализованную разницу оценивали как разность между концентрациями одной и той же имитационной пробы, рассчитанными тестируемой программой и референтной программой 5PLИфаМастер, выраженную в процентах от концентрации, измеренной референтным методом (Рис. 2-8). Для оценки сходимости расчетных данных различия между средними из 10 измерений значениями концентраций каждой «пробы пациента», вычисленными тестируемым и референтным методами, оценивали по критерию Вилкоксона для парных сравнений. При сравнении значения концентраций округляли до первого знака после запятой.

 

Результаты

Наибольший интерес для данного исследования представляло оборудование, в ПО которого представлены вместе эмпирические и теоретические методы расчета данных ИФА, а именно ПО к анализаторам Multiscan, SunRiseи BioRad680 (Табл. 2)

В таблицах 3-6 представлены результаты расчета концентраций 9 имитационных проб пациентов в конкурентном ИФА с помощью наиболее часто применяемых программ, используемых совместно с ридерами. Исходные данные показаны как средние значения из 10-ти индивидуальных измерений ОП КК и концентраций «проб» на одном и том же имитационном планшете. На рисунках  2-8 те же результаты даны в виде нормализованной разности концентраций между референтным и тестируемым методами для каждой из 9-ти имитационных проб.

На рис. 2А представлены данные, иллюстрирующие выбор программы 5PLИфаМастер в качестве метода сравнения в данном исследовании. Из изученных ПО очень близкими к референтной реализациями параметрических методов оказались программы 4PL в ПО Genesis и Ascent к анализатору Multiscan(производитель анализатора и ПО – фирма Labsystems). При сравнении средних концентраций каждой имитационной пробы различия между результатами двух способов расчета составило не более 3 % (Рис. 2А, 3, Табл. 3) и 4 % (Рис. 2А и 4, Табл. 4), для Genesis и Ascent соответственно. В таблице 9 представлены данные по числу концентраций имитационных проб, полностью совпадающих по критерию Вилкоксона и отличающихся не более чем на 5 %, от рассчитанных референтным методом. При применении последнего критерия видно, что для всех 9 имитационных проб расчетные концентрации в обеих реализациях 4 PL(Genesis и Ascent) сходны с таковыми референтного метода.

В  ПО ИфаМастер (Алкор Био), помимо метода 5PL, реализован и метод 4PL, его расчетные концентрации совпали по критерию Вилкоксона с концентрациями рассчитанными программой 4PL в ПО Genesis на 100 % для всех имитационных проб.

На борту ридера BioRad680 реализованы как 4-, так и 5 PLметоды, использующие формулы Cook-Wilkensonи Rodbard, таким образом, для пользователя доступны 4 вида параметрических методов расчета. Однако корректно реализованными оказались только 2 метода: 4PLпо Cook-Wilkensonи 5PLпо Rodbardблизки к референтному. Среди изученного ПО эти реализации параметрических методов оказались самыми близкими к референтной: различия между расчетными концентрациями во всех 9 пробах не превышало 2 %. Эти два метода оказались наилучшими и по полному совпадению концентраций в пробах с референтным методом по критерию Вилкоксона (Табл. 9). Расчет концентраций с помощью 4PLпо Rodbardзначительно отличался от референтного метода (Рис. 2Б, табл. 5), различия превышали 10 % у более половины проб, число совпадений по критерию Вилкоксона – 0 % (Табл. 9). Расчет концентрации 9-й пробы дал 60%-ное отклонение концентрации от расчетов референтным методом (Рис. 2Б). Метод 5PLпо Cook-Wilkensonоказался неработоспособным на используемой нами модели конкурентного ИФА – программа выдавала сообщение об ошибке.

Примером некорректной реализации параметрического метода является 4PLв ПО Magellanк анализатору SunRise (Tecan). Так же как и в случае 4PLпо Rodbard(BioRad680), ни одна из концентраций сывороток, вычисленных 4PLMagellanне совпадала по критерию Вилкоксона с вычисленными референтным методом (Рис. 2Б и 6, табл. 6 и 9).Программа не выполнила вычисление концентрации 9-й имитационной пробы.

В качестве иллюстрации работы метода logit-logприведем данные полученные при анализе внутреннего  ПО  ридера Униплан  АИФ ФР-01 (Пикон, Москва) в котором этот метод реализован.  На рисунке 8 видно, что  при сравнении со сплайн-аппроксимацией,  logit-logметод, реализованный во внутреннем ПО ридера Униплан, выглядит более надежным. Хотя концентрации,  рассчитанные обоими этими методами не совпадают с вычисленными референтным методом значениями по критерию Вилкоксона, все другие показатели для метода logit-log  лучше, чем для сплайн-аппроксимации.  Так, количество проб, концентрации которых имеют разницу относительно определенной референтным методом менее 5 % , для сплайн-аппроксимации 1 из 9, а для logit-log– 3 из  9. Рассчитанное методом logit-logабсолютное значение отличия от референтного метода для каждой сыворотки всегда ниже, чем рассчитанное сплайном (Рис. 8).  Хотя метод logit-logи является производным от 4PL(1), отличие определяемых с его помощью концентраций от вычисленных референтным методом  в 2-3 раза больше, чем соответствующие показатели для 4PLпо Cook-Wilkensonи 5PLпо Rodbard(BioRad680) (Рис. 8).  Для пробы № 8 это отличие даже превысило 10 %.

Анализ данных представленных в таблицах 3-6 и на рисунках 3-6, 8 показывает, что концентрации имитационных проб, вычисленные эмпирическими методами (кусочно-линейная аппроксимация и кубический сплайн), существенно отличались от таковых, вычисленных параметрическими методами и logit-log. Так, для ПО Genesisи Ascentк ридеру Multiscanразличия в расчетах концентрации одной и той же имитационной пробы достигали 30 %, как от референтного метода, так и от собственных реализаций 4PL(Рис. 3 и 4). Для обоих этих  внешних ПО характерно занижение концентрации в нижней части измеряемого диапазона при расчетах методом кубического сплайна, и завышение в верхней части методом кусочно-линейной аппроксимации (Табл. 3 и 4). Если провести сравнение трех исследованных методов расчета, реализованных в ПО Magellanк ридеру SunRise, между собой, видно, что они демонстрируют существенные, вплоть до двукратного, различия по концентрациям в одной и той же пробе (Табл. 6). Это означает, что значения концентрации искомого аналита, присваиваемые пробе пациента, в одном и том же анализе могут различаться очень существенно, в зависимости от выбора метода построения КК на основании одного и того же набора ОП калибраторов.

Следует отметить, что реализации кубического сплайна в ПО Magellanк ридеру SunRiseи во встроенном ПО к ридеру BioRad680 существенно отличаются от других,  протестированных в этом исследовании, что видно по разнице определяемых в пробах концентраций (Рис. 7).

Проиллюстрируем на конкретном примере влияние метода построения КК на клиническую значимость получаемых с ее помощью результатов. При использовании неадекватного метода расчета КК могут возникать следующие ситуации:

1) Контрольная сыворотка (КС) не попадает в заданный производителем набора диапазон концентраций. В этом случае КК считается построенной некорректно, анализ должен быть отбракован и поставлен заново. Таблица 7 демонстрирует влияние выбора метода расчета на присвоение КС той или иной концентрации. Учитывая, что все построения и расчеты выполнены с использованием имитационного планшета и на поверенном оборудовании, можно сделать вывод, что сам по себе неправильный выбор расчетной программы может приводить к ложной отбраковке всего анализа. Наибольшую междуметодную сходимость результатов демонстрируют параметрические методы разных анализаторов; в то же время отличающийся от других изученных вариант логистического 4PL по Rodbard на ридере BioRad680 присвоил КС значение ниже заявленного производителем диапазона. Наибольший разброс значений КС в данной выборке методов характерен для кубических сплайнов.

2) Даже в случае попадания значения контрольной сыворотки в указанный производителем диапазон, различия между концентрациями одной и той же пробы пациента, рассчитанными разными методами, могут оказаться весьма существенными. Проба, в которой истинная концентрация аналита находится близко к границе нормы, при использовании одних математических методов построения КК может оказаться в диапазоне нормы, при использования других может попасть в патологический диапазон (Табл. 8), причем это происходит даже в случае имитации конкурентного анализа «на стеклах», когда исключены многие случайные факторы, влияющие на проведение ИФА. Таким образом, в ряде случаев только выбор метода расчета данных может оказать влияние на постановку того или иного диагноза.

Остальные методы построения КК для определения концентрации аналитов при проведении конкурентного ИФА охарактеризованы в таблице 9. Заливкой выделены методы, при использовании которых отличия средних концентраций «проб» от вычисленных референтным методом не превышали 5 %.

 

Обсуждение данных и рекомендуемые методы расчетов

Представленные данные демонстрируют существенное влияние выбора метода расчета на такие хорошо отслеживаемые параметры, как попадание КС в заданный диапазон и трактовку результата анализа в терминах нормы и патологии. Показано, что в отсутствие неизбежных случайных ошибок, возникающих на аналитическом этапе анализа, завышение или занижение определяемых концентраций в каком-либо диапазоне зависит от метода построения КК.

Приведенные сравнительные результаты показывают, что параметрические методы расчета данных ИФА дают большую сходимость определяемых концентраций между собой по сравнению с эмпирическими методами. Эмпирические методы расчета данных в силу существенных различий в их алгоритмах дают мало сопоставимые результаты на разных участках диапазона измерения.

Хотя параметрические методы, как правило, имеют высокую надежность и воспроизводимость, следует помнить, что среди реальных 4/5 PLалгоритмов, реализованных в ПО, встречаются как более, так и менее надежные. Причина этого кроется не в математической природе параметрических методов, а в конкретной программной реализации (программном алгоритме, посредством которого данный математический метод осуществляется в реальном ПО). По этой причине надежность работы параметрических методов перед внедрением в рутинную лабораторную практику следует обязательно проверять. Методика проверки надежности работы  различных методов расчета калибровочных зависимостей в ИФА описана в Приложении 3 первой части настоящей статьи.

По результатам наших экспериментов можно рекомендовать для использования в лабораторной практике методы расчета КК, основанные на модели 4PL, реализованные во внешнем ПО фирмы Labsystems – Genesis и Ascent, а также 4 PLпо Cook-Winkensonи 5PL по Rodbardво встроенном ПО ридера Biorad 680. Эти методы дают воспроизводимые и надежные результаты расчетов.

Работоспособность параметрических методов, реализованных в ридерах АИФ (внешнее ПО ЛабАрм) и Sunrise (ПО Magellan) не была подтверждена в нашем исследовании, и эти методы не могут быть рекомендованы к использованию.

Встроенное ПО анализатора BioRad680 и внешнее ПО Ascentк анализатору Multiscanпредлагают еще один метод построения КК – сигмоидную логистическую модель. Тестирование этого алгоритма обработки данных показало, что расчетные концентрации могут оказаться близкими к результатам, полученным с помощью корректно реализованных 4PLметодов (данные не приводятся).

В рутинной лабораторной практике следует использовать предварительно проверенные на работоспособность 4PLили 5PLметоды  для расчета  концентраций не только в конкурентном, но и в сэндвич-ИФА.   Использование метода logit-logдля расчета КК в конкурентном ИФА  предпочтительнее, чем использование сплайнов и, тем более, чем использование кусочно-линейной аппроксимации.

В случае, если в распоряжении лаборатории нет прибора, снабженного ПО с доступными работоспособными реализациями расчетов КК 4 PL- , 5PL-моделей или logit-log,  лаборатория должна найти возможность для приобретения и использования независимого ПО для обработки данных ИФА. Одним из вариантов такого ПО может служить программа ИфаМастер, предлагаемая ЗАО Алкор Био.


Таблица 1. Характеристики стекол, имитирующих КП и пробы пациентов

 

 

Рисунок 1.Пример построения калибровочной кривой по стеклам имитационного планшета методом 5PLв программе ИФАМастер ЗАО «Алкор Био».


Таблица 2.Марки ИФА-ридеров, описание ПО и наличие упомянутых в методике программ

 

Обозначения:

«+» - метод представлен в ПО,

«-» - метод отсутствует в ПО,

«+*» - кубический сплайн в этом ПО реализован в двух вариантах, «Локальном» и «Глобальном»,

** -  кроме перечисленных в таблице, данное ПО содержит logit-log метод построения КК.  Данные по его изучению представлены на  Рис. 8.
  

 

Рисунок 2. Гистограмма разницы концентраций, определенных разными параметрическими методами относительно метода 5PL ИфаМастер, для 9-ти имитационных проб.

А: Genesis и Ascent – внешние ПО для ридера Multiscan, BR-4PL-C (4PL по Cook-Wilkenson) и BR-5PL-R (5PL по Rodbard) – две программы из четырех параметрических встроенного ПО ридера BioRad 680,

Б: Magellan – внешнее ПО для ридера SunRise, BR-4PL-R (4PL по Rodbard) – одна из 4-х предлагаемых параметрических программ встроенного ПО ридера BioRad 680.

Примечание: Каждый столбец диаграммы представляет собой разницу между значениями концентрации в одной и той же пробе, рассчитанными референтным и испытуемым методами.
 

 

 

Рисунок 3. Гистограмма разницы концентраций, определенных относительно метода 5PL ИфаМастер, для 9-ти имитационных проб разными методами внешнего ПО Genesis для ридера Multiscan: КС – кубический сплайн, КЛА – кусочно-линейная аппроксимация, 4PL - четырехпараметрическая логистическая модель

См. Примечание к рис. 2.

 

Таблица 3. Средние значения концентраций имитационных проб пациентов, вычисленныеразличными методами внешнего ПО Genesisдля ридера Multiscanи 5PLИфаМастер по оптическим плотностям имитационного планшета, измеренным фотометром ридера Multiscan

 

 

Рисунок 4. Гистограмма разницы концентраций, определенных относительно метода 5PL ИфаМастер, для 9-ти имитационных проб разными методами внешнего ПО Ascent для ридера Multiscan: КС – кубический сплайн, КЛА – кусочно-линейная аппроксимация, 4PL - четырехпараметрическая логистическая модель

См. Примечание к рис. 2.

 

Таблица 4. Средние значения концентраций имитационных проб пациентов, вычисленныеразличными методами внешнего ПО Ascentдля ридера Multiscanи 5PLИфаМастер по оптическим плотностям имитационного планшета, измеренным фотометром ридера Multiscan

 

 

Рисунок 5. Гистограмма разницы концентраций, определенных относительно метода 5PL ИфаМастер, для 9-ти имитационных проб разными методами встроенного ПО ридера BioRad 680: 4PL по Cook-Wilkenson, 4PL по Rodbard и 5PL по Rodbard - параметрические методы.

Пояснение: кубический сплайн не представлен на рисунке, так как отличия для разных проб находятся в диапазоне от 17 до 4000 % (см. рис. 7).

См. Примечание к рис. 2.

 

Таблица 5. Средние значения концентраций имитационных проб пациентов, вычисленныеразличными методами встроенного ПО ридера BioRad 680 и 5PLИфаМастер по оптическим плотностям имитационного планшета, измеренным фотометром ридера BioRad 680

 

 

 

 

Рисунок 6. Гистограмма разницы концентраций, определенных относительно метода 5PL ИфаМастер, для 9-ти имитационных проб разными методами внешнего ПО Magellan для ридера SunRise: КС – кубический сплайн, КЛА – кусочно-линейная аппроксимация, 4PL – четырехпараметрическая логистическая модель

См. Примечание к рис. 2.

 

Таблица 6. Средние значения концентраций имитационных проб пациентов, вычисленныеразличными методами внешнего ПО Magellanдля ридера SunRiseи 5PLИфаМастер по оптическим плотностям имитационного планшета, измеренным фотометром ридера SunRise

 


Рисунок 7. Гистограмма разницы концентраций, определенных разными кубическими сплайнами (внешние ПО Genesis и Ascent к ридеру Multiscan и внешнее ПО Magellan к ридеру SunRise) относительно метода 5PL ИфаМастер, для 9-ти имитационных проб

См. Примечание к рис. 2.

 

Рисунок 8. Гистограмма разницы концентраций, определенных  кубическим сплайном и  logit-log(встроенное ПО  Униплан АИФ ФР-01),  4PL по Cook-Wilkenson и 5PL по Rodbard (встроенное ПО  BioRad 680) относительно метода 5PL ИфаМастер, для 9-ти имитационных проб

См. Примечание к рис. 2.


 

Таблица 7. Значения концентрации контрольной сыворотки (КС), вычисленные по одним и тем же ОП различными программами, реализованными на основании разных математических методов

 

*значения концентрации КС, находящиеся за пределами заданного производителем диапазона

 

Таблица 8. Значения концентрации аналита в имитационной пробе,вычисленные различными математическими методами встроенного ПО ридера BioRad680, относительно точки принятия медицинского решения

 

*значения концентрации «сыворотки», существенно отличающиеся от концентрации в точке принятия медицинского решения и способные привести к изменению диагноза или метода ведения пациента


Таблица 9. Корректность работы методов расчета калибровочных зависимостей, реализованных в ПО анализаторов для ИФА, наиболее часто используемых в Российской Федерации.

Верхняя пара цифр в ячейке: число проб, для которых значения концентрации, определяемые тестируемым методом, совпадали по критерию Вилкоксона с определяемыми референтным методом, в скобках число проб, обработанных программой из 9 представленных в имитационном планшете. Нижняя пара цифр в ячейке: число проб, для которых значения концентрации, определяемые тестируемым методом, отличались от определяемой референтным методом  не более чем на 5 %, в скобках число проб, обработанных программой из 9 представленных в имитационном планшете.

 

 

 Список литературы:

 

 

  1. Fernandez A.A., Stevenson G.W., Abraham G.E., Chiamori N.Y. Interrelations of the Various Mathematical Approaches to Radioimmunoassay. Clin. Chem. 1983, 29 (2), 284-289
  2. Maciel, RJ. Standard Curve Fitting in Immunodiagnostics: A Primer. J. of Clin. Immunoassay 8:98-106. 1985
  3. Nix B., Wild D. Part 9. Data processing In book: Immunoassays. Practical approach. Gosling J.P. (Ed.), Oxford University press. 2000.  p. 239-260
  4. Plikaytis B. D., Turner S. H., Gheesling L. L., Carlone G. M.  Comparisons of Standard Curve-Fitting Methods To Quantitate Neisseria meningitidis Group A Polysaccharide Antibody Levels by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay J. Clin. Microbiol., Vol. 29, No. 7  July 1991, p. 1439-1446
  5. Sasaki D and Mitchell R A 2002 How to obtain reproducible quantitative ELISA results (Oxford Biomedical Research, Inc. http://www.oxfordbiomed.com/artqelis.htm)
 
«Алкор Био» © 2010 | Для писем: 192148, С-Петербург, а/я 44