С момента открытия B.Blumberg в 1964 г [4] поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), определение этого вирусного белка в сыворотке крови является определяющим лабораторным критерием в диагностике гепатита В (ГВ) [2]. Еще в 80-х годах прошлого века была отмечена корреляционная связь между титром HBsAg, обнаружением в сыворотке крови HBeAg – антигена вируса ГВ, ассоциирующегося с вирусной репродукцией, и выраженностью патологических изменений в ткани печени [1]. Поэтому уже в то время уделялось внимание определению титра HBsAg в клинической практике.
Инновацией в области определения маркеров ГВ явилась разработка в начале 2000-х годов компанией Abbott Laboratories (США) стандартизованного хемилюминесцентного теста, позволяющего измерять количество поверхностного антигена ГВ в международных единицах [8]. Несколько позже подобный тест разработала и Швейцарская компания Roche Diagnostics [14]. Исследования, проведенные в различных странах, показали широкое варьирование количественных характеристик HBsAg у пациентов с хронической ГВ инфекцией в процессе естественного развития и достаточно сильную корреляцию между уровнями поверхностного антигена, обнаружением HBeAg и уровнем ДНК вируса ГВ в крови [7, 9, 10, 12, 15, 16].
Современная практика исследований маркеров ГВ показала, что предпочтительным маркером при мониторинге течения хронического ГВ и его терапии является количественное определение HBsAg. Установлено значительное снижение уровней поверхностного антигена при сероконверсии HBeAg в anti-HBe, что является одним из критериев успешности терапии [3, 5, 6, 13, 17, 18].
Таким образом, широкое использование количественного определения HBsAg у пациентов с ГВ может оказаться весьма полезным для прогноза естественного течения инфекции и оценки эффективности лечения.
Стоит отметить, что наряду с зарубежными тестами для количественного определения HBsAg, теперь на российском рынке есть новый продукт, который, несомненно, будет способствовать решению указанных задач – набор реагентов «ГепатитИФА-HBsAg», разработанный компанией «Алкор Био» (Санкт-Петербург, Россия). Уникальностью данной тест-системы является возможность ее использования как для качественного, так и для количественного определения HBsAg в сыворотке и плазме крови человека методом иммуноферментного анализа (ИФА)
На базе НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург были проведены клинические испытания новой тест-системы «ГепатитИФА-HBsAg», в рамках которых проводилась оценка чувствительности и специфичности набора.
Материалы и методы
Тест-системы:
Набор реагентов «ГепатитИФА-HBsAg» предназначен для качественного и количественного определения HBsAg в сыворотке и плазме крови человека.
В наборе «ГепатитИФА-HBsAg» реализован «сэндвич»-вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для этого использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к HBsAg. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с пероксидазой хрена. В лунках, при добавлении исследуемого образца и конъюгата анти-HBsAg-пероксидаза, во время инкубации одновременно происходит иммобилизация HBsAg, содержащегося в исследуемом образце, и связывание его с конъюгатом. При удалении содержимого из лунок и промывке происходит удаление избытка конъюгата анти-HBsAg-пероксидаза, не связавшегося с иммобилизованным в ходе инкубации HBsAg. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству HBsAg в исследуемом образце.
Во время инкубации с раствором ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна концентрации HBsAg в анализируемых пробах. После измерения оптической плотности раствора в лунках, на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация HBsAg в исследуемых образцах.
Коммерческая тест-система для количественного определения HBsAg методом хемилюминисцентного анализа (ХЛА) «ARCHITECT HBsAg» производства Abbott Laboratories (США) использовалась в качестве референтной.
Исследование сывороток проводили согласно инструкциям по применению фирм изготовителей наборов «ARCHITECT HBsAg» и «ГепатитИФА-HBsAg». Измерение концентрации HBsAg в пробах проводилось параллельно на двух тест-системах.
Исследуемые сыворотки
Оценка результатов количественного определения HBsAg проводилась на панели сывороток, состоящей из 80 положительных (содержащих HBsAg) и 80 отрицательных (не содержащих HBsAg) образцов. Все сыворотки этой панели были отобраны из числа предварительно исследованных на содержание HBsAg в ИФА с использованием тест-систем «HBsAg-ИФА-Бест» (Вектор Бест, Новосибирская обл.) и «ImmunoComb II HBsAg 90» (Orgenics, Израиль) при обследовании пациентов с различными формами гепатита В. До настоящего тестирования образцы хранились в условиях глубокого холода при -85ºС и размораживались непосредственно перед исследованием.
Оборудование
Регистрация результатов ИФА проводилось на спектрофотометре вертикального сканирования BioRad 680 (BioRad, США), а ХЛА – на хемилюминисцентном автоматическом анализаторе ARCHITECT I-1000SR (Abbott Laboratories, США).
При анализе полученных данных оценивалось соответствие результатов, полученных с помощью наборов «ГепатитИФА-HBsAg» и «ARCHITECT HBsAg».
Результаты и обсуждение
В результате проведенных исследований, все 80 HBsAg-позитивных образцов исследуемой панели оказались позитивными в ХЛА («ARCHITECT HBsAg»). Из 80 тестированных положительных образцов, в которых обнаружение HBsAg подтверждено в ХЛА референтной тест-системе, сравниваемая тест-система «ГепатитИФА-HBsAg» производства компании «Алкор Био» обнаружила HBsAg во всех 80 образцах.
Из 80 тестированных HBsAg-отрицательных образцов, в которых также не обнаружен HBsAg с помощью референтного набора «ARCHITECT HBsAg», испытуемая тест-система «ГепатитИФА-HBsAg» не обнаружила HBsAg ни в одном образце.
Таким образом, в настоящем исследовании установлено:
· число «истинно положительных» результатов – 80;
· число «ложно отрицательных» результатов – 0;
· число «истинно отрицательных» результатов – 80;
· число «ложно положительных» результатов – 0.
Чувствительность тест-системы, рассчитанная по формуле (1) составила 100 %.
Число «истинно положительных» образцов х100% (1)
Число «истинно положительных» образцов + Число «ложно отрицательных» образцов
Специфичность тест-системы также составила 100% и рассчитывалась по формуле (2):
Число «истинно отрицательных» образцов х100% (2)
Число «истинно отрицательных» образцов + Число «ложно положительных» образцов
При сравнении количественного уровня HBsAg в исследуемых образцах установлены сопоставимые показатели, полученные в обеих тест-системах, при коэффициенте корреляции r = 0,99. В качестве примера в таблице 1 суммированы результаты измерения количества HBsAg в низкотитражных образцах испытуемой панели.
Таблица 1 Результаты измерения количественного содержания поверхностного антигена вируса ГВ в образцах испытуемой панели сывороток с низким содержанием антигена
№ образца
Концентрация HBsAg в МЕ/мл
ARCHITECT HBsAg
«ГепатитИФА-HBsAg»
83 34,9 42,0
91 0,98 1,2
98 14,3 17,0
101 58,0 65,0
102 33,0 29,0
107 16,0 16,0
109 16,6 18,0
119 10,1 8,0
Выводы
Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:
Разработанная тест-система «ГепатитИФА-HBsAg» для качественного и количественного определения HBsAg обладает высокой чувствительностью и специфичностью.
Количественное содержание HBsAg в исследованных образцах совпали при тестировании в испытуемой и референтной тест-системах и показали высокую корреляцию данных (r = 0,99).
Таким образом, тест-система «ГепатитИФА-HBsAg» производства компании «Алкор Био» может быть рекомендована для широкого применения в клинической практике как для проведения скрининговых исследований, так и для мониторинга лечения и глубокого изучения естественного течения гепатита В.
Литература
Мукомолов С.Л. Эпидемиологическая и клинико-лабораторная характеристика хронических носителей HBsAg в зависимости от выраженности патологического процесса.// Автореф. дисс. канд. мед. наук Л. 1984. – 24 с.
Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика). – М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2003. – 384 с.
Andersson K.L., Chung R.T. Monitoring during and after antiviral therapy for hepatitis B.// Hepatology. – 2009. – vol. 49. – p. 166-173
Blumberg B.S., Alter H.J., Visnich S.A. A “New” antigen in leukemia sera.// JAMA. – 1984. – vol. 252, N2. – p. 352-257
Brunetto M.R., Moriconi F., Bonino F. et al. Hepatitis B virus surface antigen levels: a guide to sustained response to peginterferon alfa-2a in HBeAg-negative chronic hepatitis B.// Hepatology. – 2009. – vol. 49, N4. – p. 1141-1150
Chan H.L., Wong V.W., Tse A.M. et al. Serum hepatitis B surface antigen quantification can reflect hepatitis B virus in the liver and predict treatment response.// Clin. Gastroenterol. Hepatol. – 2007. – vol. 5, N12. – p. 1462-1468
Chan H.L., Wong V.W., Wong G.L. et al. A longitudinal study on the natural history of serum hepatitis B surface antigen changes in chronic hepatitis B.// Hepatology. – 2010. – vol. 52, N4. – p. 1232-1241
Deguchi M., Yamashita N., Kagita M. et al. Quantitation of hepatitis B surface antigen by an automated chemiluminiscent microparticle immunoassay.// J. Virol. Methods. – 2004. – vol. 115. – p. 217-222
Jaroszewicz J., Calle Serrano B., Wursthorn K. et al. Hepatitis B surface antigen (HBsAg) levels in the natural history of hepatitis B virus (HBV) – infection: a European perspective.// J.Hepatol. – 2010. – vol.52, N4. – p.514-522
Kim Y.J., Cho H.C., Choi M.S. et al. The change of the quantitative HbsAg level during the natural course of chronic hepatitis B.// Liver Int. – 2011. – vol. 31, N6. – p. 819-825
Lee J.M., Ahn S.H. Quantification of HBsAg: Basic virology for clinical practice. // World J. Gastroenterol. – 2011. – vol. 17, N3. – p. 283-289
Lee J.H., Kim S.J., Ahn S.H. et al. Correlation between quantitative serum HBsAg and HBV DNA test in Korean patients who showed high level of HBsAg.// J. Clin. Pathol. – 2010. – vol. 63, N 11. – p. 1027-1031
Lee M.H., Lee da M., Kim S.S. et al. Correlation of serum hepatitis B surface antigen level with response to entecavir in naive patients with chronic hepatitis B.// J. Med. Virol. – 2011. – vol. 83., N7. – p.1178-1186
Muhlbacher A., Weber B., Burgisser P. et al. Multicenter study of a new fully automated HBsAg screening assay with enhanced sensitivity for the detection of HBV mutants.// Med. Microbiol. Immunol. – 2008. vol. 197. – p. 55-64
Nguyen T., Thompson A.J., Bowden S. et al. Hepatitis B surface antigen levels during the natural history of chronic hepatitis B: a perspective on Asia.// J.Hepatol. – 2010. – vol.52, N4. – p. 508-513
Su T.H., Hsu C.S., Chen C.L. et al. Serum hepatitis B surface antigen concentration correlates with HBV DNA level in patients with chronic hepatitis B.// Antivir. Ther. – 2010. – vol. 15, N8. – p. 1133-1139
Tangkijvanich P., Komolmit P., Mahachai V. et al. Comparison between quantitative hepatitis B surface antigen, hepatitis B e-antigen and hepatitis B virus DNA level for predicting virological response to pegilated interferon-alpha-2b therapy in hepatitis B e-antigen-positive chronic hepatitis B.// Hepatol.Res. – 2010. – vol.40, N4. – p.269-277
Wang X.Y., Zhang X.X., Yao X. et al. Serum HbeAg sero-conversion correlated with decrease of HbsAg and HBV DNA in chronic hepatitis B patients treated with a therapeutic vaccine.// Vaccine. – 2010. – vol. 28, N5. – p. 8169-8174
Авторы: С.Л. Мукомолов, д-р мед. наук, профессор, зав. лабораторией вирусных гепатитов, Н.В. Иванова, научный сотрудник, В.В. Ермолина, врач КДЛ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург А.Л. Мукомолова, канд. мед. наук,старший научный сотрудник ФГУ “ФЦСКЭ им. В.А. Алмазова Росмедтехнологий”, Санкт-Петербург, Журнал "Справочник заведующего КДЛ"
