Очистка
Методы очистки олигонуклеотидов.
Для всех олигонуклеотидов,в зависимости от их структуры (длина, наличие модификаций) и масштаба синтеза, подбираются соответствующие способы очистки для получения максимально чистого продукта в кратчайшие сроки. На всех стадиях очистки используется специально подготовленная вода и растворы, что обеспечивает длительные сроки хранения и высокую стабильность синтезированных олигонуклеотидов. Основными способами очистки являются:
Гель-фильтрация (ГФ или обессоливание; степень очистки 80-90%)является основным способом очистки для немодифицированных олигонуклеотидов длиной не более 40 оснований и олигонуклеотидов с большим количеством вырождений (более пяти). Очищенные таким способом олигонуклеотиды могут быть использованы для стандартной ПЦР, производства ДНК-чипов, секвенирования. Для использования в генно-инженерных работах необходима дополнительная очистка ПААГ.
Обратно-фазовые картриджи (ОФ-картрижи; степень очистки более 90%)используются для очистки немодифицированных олигонуклеотидов с длиной не более 40 оснований, а также олигонуклеотидов с модификациями аминогруппой или инозином. Очищенные таким способом олигонуклеотиды могут быть использованы во всех работах, кроме генно-инженерных.
Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ электрофорез; степень очистки 95-99%)используется для очистки олигонуклеотидов длиной более 40 оснований, олигонуклеотидов с модификациями флуорофорами (кроме Су) или гасителями, а также флуоресцентных зондов. Необходим для очистки всех олигонуклеотидов для генно-инженерных работ.
Высокоэффективная жидкостная хроматография на обратной фазе (ОФ-ВЭЖХ, степень очистки 95-99%)позволяет очищать большие количества любых олигонуклеотидов (20 о. е. и выше), олигонуклеотиды с модификациями флуорофорами, гасителями и флуоресцентные зонды. Часто используется как дополнительный способ очистки для всех типов олигонуклеотидов.
|
Рекомендуемые способы очистки |
Гель-фильтрация (обессоливание) |
ОФ-Картриджи |
ПААГ электрофорез* |
ОФ-ВЭЖХ* |
|
Степень очистки |
80-90% |
90-95% |
95-99% |
95-99% |
|
Немодифицированные олигонуклеотиды |
||||
|
Длиной до 40 н.о. |
+ |
+ |
(+) |
|
|
Длиной более 40 н.о. |
|
|
+ |
+ |
|
С вырожденностью более 5 н.о |
+ |
|
(+) |
|
|
В количестве от 20 о. е. |
|
|
|
+ |
|
(+) Все немодифицированные олигонуклеотиды для применения в генной инженерии должны быть дополнительно очищены методм ПААГ. |
||||
|
Модифицированные олигонуклеотиды |
||||
|
С аминолинкером или инозином |
|
+ |
|
|
|
С биотином |
|
|
+ |
|
|
С флуорофорами (кроме Cy) или гасителями |
|
|
+ |
|
|
С флуорофорами Cy3, Cy5 |
|
|
|
+ |
|
Флуоресцентные зонды** |
|
|
+ |
+ |
* - Может использоваться для дополнительной очистки (если не основная).
** - Рекомендуется двойная очистка ПААГ+ОФ-ВЭЖХ.
Методы контроля:
Все олигонуклеотиды проходят обязательную стадию контроля чистоты с помощью ПААГ электрофореза или ОФ-ВЭЖХ, а также измерения количества (концентрации) методом спектрофотомерии.
